online kép - Fájl  tube fájl feltöltés file feltöltés - adja hozzá a fájlokat online fedezze fel a legújabb online dokumentumok Kapcsolat
   
 

Letöltheto dokumentumok, programok, törvények, tervezetek, javaslatok, egyéb hasznos információk, receptek - Fájl kiterjesztések - fajltube.com

 

Online dokumentumok - kep
   

NUSTAT SEJTMAGDETEKTÁLÓ ÉS ELEMZŐ RENDSZER

vegyes

Fájl küldése e-mail Esszé Projekt

egyéb tételek

 
Szövettan
Operaciós rendszerek
A vizsgamodell
NAPI TEVÉKENYSÉGI TERV
Tanmenetjavaslat az 5. évfolyam Természetismeret tantargyhoz
Logisztikai kifejezések
Ébren almodók: A Harmadik Szem Aktivizalasa És Alapfokú Hasznalata
MAGYAR SZABVÁNY MSZ ISO 8501-1
REND A SZÓHALMAZBAN Bemutatkozó dolgozat
A történelem és a földrajz hatarai
 
 

TUDOMÁNYOS DIÁKKÖRI DOLGOZAT

nUSTAT SEJTMAGDETEKTÁLÓ ÉS ELEMZŐ RENDSZER

Bevezető

A TDK dolgozat fő témája a gyógyszerkutató cégek által végzett állatkísérletek számítógépes elemzése. A kísérletek során a kísérleti állatokat bizonyos anyagokkal kezelik, majd egy meghatározott idő után „feláldozzák”. A boncolt állati szervből (pl.: veséből) mintát vesznek (szövetminta), melyből 3-4 mm vastag szeletet üveglapra helyeznek. Így lehetőség van a szövetmintákat tárgylemezenként különböző festékkel megfesteni. Az ily módon készült mintákat egy speciális digitális mikroszkóppal digitalizálják.

A dolgozat részletesen ismerteti az általunk kifejlesztett NuStat programban alkalmazott algoritmusok működési elvét. A program segítségével hasznos funkciókkal segíthetjük a toxikopatológusok munkáját. A program automatikusan detektálja a digitalizált szövetmintákon a megfestett sejtmagokat, majd azokon morfometriai méréseket végez, végül pedig statisztikailag elemzi a mért eredményeket, s dokumentálja is azokat.

A statisztikai elemzés által tized másodperc alatt eldől, hogy az aktuális képen található sejtmagok szignifikánsan eltérnek-e az adatbázisban tárolt normál (nem kezelt állatokból vett minta) sejtmagok mintáitól, vagy sem.


1. Tudományos alapok

          A sejt a földi élet legkisebb szerkezeti egysége, amely önálló működésre képes valamint életjelenségeket mutat, anyagcserét folytat és szaporodik. Vannak olyan organizmusok, mint a baktériumok és egysejtűek, amelyek csak egy sejtből állnak, az ember illetve a többsejtű állatok viszont akár 100 000 milliárd (1014) sejtből is állhatnak. A sejtet egy külső membrán vagy más néven sejthártya határolja, melyen belül egy folyékony szerves anyag található.

            A legegyszerűbb sejtes felépítésű élőlények a prokarióták. Ezeknek nincs belső membránnal határolt sejtmagjuk. A sejtmagvas élőlények az eukarióták. Fénymikroszkóppal vizsgálva az eukariót 222j99c a sejtek két fő részből állnak:

            – a magból (latinul: nucleus)

            – és a magot körülvevő citoplazmából

A sejtmagot két lemezből álló maghártya veszi körül, melyen pórusok helyezkednek el. Ezen keresztül történik a citoplazma és a mag közötti anyagáramlás. A mag belsejében jól elkülöníthető a magvacska (latinul: nucleolus) és a fonalas szerkezetű DNS-t és fehérjéket tartalmazó kromatin állomány. [1]

          A sejtmag mérete különböző lehet, és alakja is meglehetősen változó, attól függően, hogy milyen környezetben (pl. a test melyik szervében) található. A leggyakoribb a gömb forma. Minél aktívabb egy sejtmag, annál nagyobb a felülete és a térfogata közötti arány.

A vesében lévő sejtmagok jellemzően kör alakúak. Ezt a tulajdonságot vettük alapul a feladat megoldása során. A program kódját Delphi környezetben fejlesztettük.


2. Előfeldogozás

          A dolgozat alapját egy régebben kiírt bioinformatikai verseny adta, melynek feladatkiírása lényegében a felvetett probléma számítógépes alkalmazásának megírását jelentette. A rendelkezésre álló szövetminták 8-8 képből álltak, melyek kezelt illetve normál állat veséjéből vett minta alapján készültek.

1. kép: Egy kezelt állati veséből vett szövetminta

A szövetmintán (1. kép) a sejtmagok elég jól elhatárolódnak a háttértől. Vannak olyan szennyeződésből eredő foltok, amelyek nem sejtmagok, ezek nehezítik a probléma megoldást. Olyan sejtmagok is vannak a mintában, amelyek éppen az osztódás valamelyik fázisában vannak, és még nem vált külön a két sejtmag.

Az első lépés szinte minden képfeldolgozási probléma esetében, hogy leszűkítsük az információk tömegét, és csak azzal a résszel foglalkozzunk részletesebben, ami a feladat megoldása szempontjából szükséges. Ez a felesleges területek elhagyását jelenti, ami általában több lépésben történik, és feladat specifikus.

Az elő-feldolgozás lényege tulajdonképpen az, hogy a sejtmagok valamint a háttér – valamilyen módszer alkalmazása után ­­­­­­­– egyértelműen elkülönüljenek egymástól, és különválasztásuk egy automatizált módszerrel információvesztés nélkül működjön.

2.1 Elő-feldolgozás megvalósítása

          A szövetmintákat egy úgynevezett Hematoxilin-Eozin nevű festékkel színezik. Egészen pontosan ez két festési folyamatot jelent egymás után. A Hematoxilin-t a sejtmagok megfestésére használjak, melynek következtében kék színnel válik láthatóvá. Ezután következik az Eozin-festés, melynek eredménye, hogy a színtelen sejtplazma rózsaszínné válik. Az Eozin hatással van a már kék színű sejtmagokra is, és ezért lesz sötét lilás színű, ahogyan az 1. képen látható. [2]

Az információk tehát a vörös színtartományban vannak, ezért a kép R színcsatornáját használhatjuk a további feldolgozáshoz. Az R csatornás képen (2. kép) a sejtmagok jobban elkülönülnek a sejtplazmától, valamint ezáltal a három csatornás (RGB) képből már csak eggyel kell tovább dolgozni, ami gyorsítja a feldolgozást.

         

2. kép: az eredeti kép R színcsatornája


3. Küszöbülés

A háttér kiszűrésére számos technika és algoritmus létezik, de természetesen itt sem találunk olyan algoritmust, amely minden problémára ugyanolyan jól működne, tehát mindig az adott specifikáció határozza meg, hogy a problémánál mi a legmegfelelőbb és leghatékonyabb megoldás. Ez az előszűréstől is függ, ami tulajdonképpen előkészíti és segíti a hatékony háttérszűrést. A legegyszerűbb megoldás a küszöbölés, ami sok esetben hatékony és gyors. Egyetlen problémája, hogy alapfeltételként kell teljesülni, hogy az objektumnak és a háttérnek eltérő intenzitásúnak (nagy kontraszt) kell lennie, valamint homogénnek (pl. sötét objektum világos háttéren).

A küszöbölés lényegében egy feltételvizsgálat, mely a képen található összes pixelt egyenként vizsgálja és eldönti az adott pixelről, hogy az objektum vagy háttér. A feltételvizsgálathoz meg kell adni egy küszöbértéket, ami alapján a feltételvizsgálat kiértékelődik.

A küszöbölés az alábbi képlettel írható le:

ha f(x,y)<=K à t(x,y)=1 (objektum)

ha f(x,y)>K à t(x,y)=0 (háttér)

            ahol az f(x,y) az inputkép, t(x,y) az eredménykép és K a küszöbérték.

A küszöbérték meghatározása lehet a képtől független, rögzített érték, vagy kontrolált, azaz a kép tulajdonságai alapján meghatározott érték. A rögzített érték viszont csak olyan esetekre alkalmazható, ahol az input képek tulajdonságai csak minimális mértékben különböznek. Az adaptív eljárások viszont az input képhez automatikusan választják ki az optimális küszöbértéket:

- Globális hisztogramból klaszterezéssel számított érték

- Lokálisan változó érték


3.1 Globális threshold számítás

        Egy kép különböző árnyalatú képpontokból, pixelekből áll. Világosságértékei a feketétől a fehérig terjednek (szürkeárnyalatos kép esetében). A hisztogram vízszintes tengelye a világossági értékeket mutatja a nullától a maximumig, melyek között 256 osztás van. A képen látható (1. ábra) grafikon megadja minden egyes színárnyalathoz a képen, az adott árnyalatú pixelek számát.

1. ábra: Az eredeti kép R színcsatornája alapján készített hisztogram

A globális threshold számítási módszerek alapja a bemeneti kép alapján készített hisztogram. Az elemzés ez alapján történik.

Otsu algoritmus [3]

Lényege, hogy megkeressük azt a T küszöbszámot, amely maximalizálja az objektum-háttér közötti varianciát, vagyis a szórás négyzetet. A homogén régiónak ugyanis kicsi a varianciája. Első lépésként a normalizált hisztogramnál minden szürkeárnyalathoz (i-hez) meg kell határozni az előfordulás gyakoriságát. A továbbiakban a hisztogram minden egyes pontjában ki kell számolni azoknak a pixelcsoportok gyakoriságát, középértékét és varianciáját, amelyek az adott pont előtt illetve mögött vannak. A T küszöbszámot úgy kell beállítani, hogy a két osztály közötti variancia a legnagyobb legyen és az osztályon belüli variancia pedig a legkisebb. A számolás időigényes a bonyolult számítási folyamatok miatt.

Isodata algoritmus [4]

Az algoritmus lényege, hogy a kép alapján kapott hisztogramot két részre osztjuk, ez lesz a kezdő küszöbérték T0 (célszerűen a hisztogram felezőpontján). Ezután kiszámítjuk az egyik, illetve másik oldal intenzitásának középértékét (KJi, KBi). Ezt követően a küszöbérték az alábbi képlet alapján módosul:. Ez a ciklus addig tart, míg Ti+1 nem lesz egyenlő Ti-vel, vagyis a küszöbérték már nem módosul.

Varriancia differencia between classes [5]

Lényege, hogy a háttér és az objektum közötti variancia a legnagyobb, és a két osztályon belüli pedig a legkisebb legyen.

A módszer az Otsu algoritmus pontosságát és az ISODATA algoritmus hatékonyságát ötvözi. Első lépésként szintén meg kell határozni egy vagy több kiinduló küszöbértéket, attól függően, hogy mennyi osztályra kívánjuk felosztani a képet. Hasonlít az Isodata módszerhez, abban tér el, hogy nem a variancia értékét adja eredményül, hanem egy küszöb értéket. Tehát itt sem kell a képletet kiszámolni a hisztogram összes értékére, hanem össze lehet hasonlítani a kapott küszöbértéket a kiinduló küszöbértékkel. Ezért ez a módszer is csak addig fut, amíg eltérés van a két osztály között.

3.2 Lokális threshold számítás [6]

          A lokálisan változó küszöbölés akkor alkalmazzák, ha az objektum vagy a háttér nem homogén, illetve ha a különböző megvilágítás miatt az objektum és a háttér szétválasztásához egy küszöbérték nem elegendő. Ilyen a Niblack algoritmus, mely változó küszöbértékeket használ, azaz követi az intenzitásváltozásokat.

3.3 Megfelelő algoritmus kiválasztása

          A legfontosabb szempont esetünkben az volt, hogy a szűrés ne legyen veszteséges, azaz a sejtmagok ne vesszenek el, illetve a sejtmagokból ne vesszenek el darabok – legfőképpen a méretük ne változzon. Viszont az is szempont volt, hogy minél több olyan területet zárjunk ki a további feldolgozásból, amire nincs szükségünk.

            A megfelelő algoritmus megválasztásához sorra kipróbáltuk az irodalomkutatás alapján talált technikákat. Az elő-feldolgozást követően tulajdonképpen egy szürkeárnyalatos képet kaptunk, amire az imént leírt algoritmusok mindegyike alkalmazható.

            Elsőként a rögzített küszöbérték meghatározását próbáltuk ki egy segédprogram segítségével. Ez egy egyszerű és gyors eljárás, melyben manuálisan tudjuk állítani a küszöbértéket. A küszöbölést mindegyik képre elvégeztük és elmentettük az adott képre vonatkozó értéket. Mivel az értékek nagyon eltérőek voltak (nagy volt a szórásuk), ezért ezt az eljárást elvetettük.

 A globális threshold számítástól vártuk a megfelelő eredményt, mivel ezek az algoritmusok automatikusan választják ki az adott kép tulajdonságai alapján az optimális küszöbértéket.

Mindhárom eljárás közel azonos eredményt adott, amint az az alábbi táblázatból
(1. táblázat) is kiolvashatunk.  

Kép neve

Otsu’s method

Var. diff. between classes

Isodata

kezelt01.jpg

204

206

202

kezelt02.jpg

207

208

206

kezelt03.jpg

181

183

180

kezelt04.jpg

-

183

179

kezelt05.jpg

209

211

208

kezelt06.jpg

202

203

201

kezelt07.jpg

208

209

207

kezelt08.jpg

210

212

209

normál01.jpg

199

199

198

normál02.jpg

196

196

195

normál03.jpg

197

199

196

normál04.jpg

-

192

190

normál05.jpg

216

216

214

normál06.jpg

-

214

213

normál07.jpg

215

216

214

normál08.jpg

211

212

210

1. táblázat: a globális threshold algoritmusok alapján kapott küszöbértékek

Mivel az Otsu metódus 3 képre nem működött – hiba generálódott –, ezért ezt az algoritmust elvetettük. A lokálisan változó küszöbölést azért nem próbáltuk ki, mert semmi nem indokolta alkalmazását.

A legalkalmasabb módszernek az Isodata algoritmust találtuk, mivel amellett, hogy megfelelt a kritériumoknak, a küszöbérték meghatározása is kevesebb időt vett igénybe, mint a többi algoritmus esetében.

Az eredményképen (3. kép) látható, hogy a sejtmagok tökéletesen elkülönültek a háttértől. Viszont nem minden sejtmag lett teljesen lefedve, vannak olyanok, amelyeknek a belseje lyukas maradt. Ez csak akkor jelentene problémát, ha sejtmag szélének egy része is lefedetlenné válna a küszöbölést követően. De mivel a sejtmagot körbe vevő burok színintenzitása magasabb, ezért szinte kizárható, hogy ez bekövetkezzen. A magok belsejét viszont ki kell tölteni a terület meghatározása, illetve a további feldolgozás miatt.

3. kép: Isodata algoritmus eredményképe


4. Objektumok belsejének kitöltése Floodfill függvénnyel

Az algoritmus lényege, hogy a kiválasztott színnel – feketével – képes kitölteni a megadott színű pixelek összefüggő csoportját. Így ez az algoritmus addig fut, amíg talál olyan szomszédos pixelt, amit még át kell színezni. Az eljárást esetünkben arra használtuk, hogy a sejtmagok közötti hátteret kitöltsük. Ezt követően egy olyan képet kapunk, amelyben a fehér pixelek a kitöltendő lyukakat mutatják. Az eredeti kép (3. kép) és a floodfill eredménykép NAND kapcsolatából kapjuk a 4. képet.

4. kép: Az objektumok belsejének kitöltése után kapott kép

NAND kapcsolat jelen esetben három feltételből áll:

Eredeti kép

Floodfill kép

Eredménykép

Fekete

Fekete

Fekete (objektum)

Fehér

Fehér

Fekete (lyuk)

Fehér

Fekete

Fehér (háttér)


5. Kerület és területszámítás

            A statisztikai elemzésünk egyik meghatározó tényezője a sejtmagok mérete, és a formája. Cél, hogy minden egyes sejtmag morfometriai adatát meghatározzuk, hogy az elemzéshez megfelelő adat álljon rendelkezésünkre. Ezért első körben minden egyes objektum adatait eltároltuk (befoglaló keret méretét és pozícióját, kerületi és területi pontjait).

A gyorsítás érdekében egy olyan eljárást alkalmaztunk, ami minden egyes objektumhoz különböző értéket – színt rendelt (5. kép).

5. kép: Minden objektumhoz más-más színt rendelve

Egyszerűbb és gyorsabb lesz az eljárás, mivel a területi illetve kerületi pontok tárolását és a befoglaló téglalapok adatait is dinamikusan tudtuk meghatározni. Ez utóbbi a vizuális megjelenítés céljából, valamint a képen látható kisebb-nagyobb pixelcsoportok szűrésénél lesz fontos.


6. Szűrések

A további feldolgozás abból áll, hogy a sejtmag tulajdonságainak nem megfelelő objektumokat kizárjuk. Nulladik szűrésként azokat a befoglaló kereteket zártuk ki, melyek kisebbek egy 10*10-es négyzetnél. Ezáltal azokat a pixelcsoportokat vetjük el, amelyek lassítanák a további feldolgozást.

Az első szűrés a befoglaló keret oldalaránya alapján történik. Mivel a sejtmagok jellemzően kör alakúak. Ha a befoglaló keret magasságát illetve szélességét elosztjuk egymással, akkor egy kör esetében 1-et kell kapnunk. Ha ez az érték nagymértékben eltér ettől, akkor az az objektum nagy valószínűséggel nem egy sejtmagot takar. Az első szűrés lényegében egy két küszöbértékes Isodata algoritmus alkalmazása.

6. kép: A szűrés alapján az egyes kategóriákba sorolt objektumokra egy-egy példa

          A szűrést követően három csoport alakul ki. Az első csoportba kerülnek azok az objektumok, amelyek a két küszöbérték közé esnek (6. kép középen). A másodikba azok, amelyek az első küszöb alattiak, de méretük miatt azt feltételezzük, hogy két vagy több összeragadt sejtet takarnak (6. kép jobbra). A harmadik csoportba tartoznak azok, amelyeket kizártunk, és ezekkel a későbbiekben már nem foglalkozunk (6. kép balra).


6.1. Alaksajátosság [7]

          Második szűrésként alkalmazzuk. Feladat az, hogy minden kerek sejtmagot megtaláljon. A statisztikai kiértékelés alapját ugyanis az képezi, hogy hány darab egészséges (kerek) és mekkora méretű sejtmag található a szövetmintában. Természetesen az, hogy „kerek” az egy relatív dolog, ezért úgy gondoltuk, hogy bevezetünk egy mérőszámot, amivel ezt le tudjuk írni. Az eljárás a kör tulajdonságát veszi alapul. Ha a kör középpontjától minden egyes kerületi pontjáig mért távolságot rendre felmérjük egy számegyenesre (7. kép), akkor egy konstans egyenest kapunk (A).

 

7. kép: Alaksajátosság

Minél kevésbé tér el az adott objektum a körtől, annál jobban közelíti a konstans egyenest. Tehát még azt is meg kell határozni, hogy mennyire közelíti a kapott eredmény az egyenest.

Mi ezt úgy oldottuk meg, hogy meghatároztuk az adott objektum súlypontját, ezt a pontot „neveztük ki” a kör középpontjának.


Ezután végighaladva az objektum kerületi pontjain felvettük egy számegyenesre a súlypont és a kerületi pontok távolságát (8. kép). A kapott távolságértékeknek vettük a maximum és minimum értékének különbségét (M). Mivel ez a távolság kis objektumok esetében értelemszerűen kisebb, mint egy nagy objektumnál, ezért az objektummérettől tettük függővé a kerekség mértékét:

kerekség = (M / objektumterület) * 10000

8. kép: Egy objektum alaksajátosság alapján való elemzése

Ez az érték minél kisebb, annál jobban közelíti az adott objektum a kört, ha értéke 0, akkor egy szabályos körről van szó. A szűrés lényege, hogy egy a megadott küszöbértéknél nagyobb értékű objektumokat elvetjük. Ezt a threshold értéket 85-re állítottuk alaphelyzetben (de ezt manuálisan is lehet szabályozni).


6.2. Az összeragadt sejtmagok szétvágása (Borgefors) [8]

Az összeragadt sejtmagokat úgy gondoltuk, hogy érdemes valamilyen eljárással szétválasztani egymástól. Ha ezt nem tesszük meg, akkor olyan sejtmagokat zárunk ki a vizsgálatból, amelyek külön-külön megfelelnének a feltételeknek. Ez, ha nem is nagymértékben, de befolyásolná a kapott eredményt.

Ez nem bizonyult egyszerű feladatnak, mivel a sejtmagok számtalan módon kapcsolódhatnak egymáshoz, akár láncban is (9. kép).

9. kép: Egy-egy példa a különböző objektum összeragadásokból

Megpróbáltuk leegyszerűsíteni a problémát azzal, hogy először azokat az eseteket vettük, ahol csak két objektum van összeragadva. Ez az eset abból a szempontból egyszerűbb, hogy csak azt kell meghatároznunk, hogy hol a legvékonyabb a kapcsolódási felület a két alakzat között. Ez speciális esetekben nagyon könnyen meghatározható, például, ha a két alakzat vízszintesen helyezkedik el (9. kép/1.) vagy ha függőleges helyzetben vannak (9. kép/3.). Ezekben az esetekben elég összeszámolni az egyes sorokban illetve oszlopokban az objektum pixelek számát, és ott, ahol ez az érték a legkisebb, ott lesz a legvékonyabb a kapcsolódási felület.

10. kép

Az előző megfogalmazás nem teljesen precíz, mert nem a minimum érték lesz minden esetben a jó megoldás, mint ahogy az a 10. képen is látható. Azt a lokális minimumot keresünk, amely a két alakzat kapcsolódásánál található.

A problémát az jelenti, hogy a legtöbb esetben nem ilyen speciális az eset, hanem az objektumok átlósan (9. kép/7.) illetve különböző szögekben érintkeznek
(9. kép/5.). Ekkor ez az eljárás ebben a formában nem is alkalmazható.

            Viszont ha tudnánk az alakzatok elfordulási szögét, akkor vissza lehetne vezetni a problémát az előző esetre. Ehhez meg kell határozni mindkét objektum súlypontját, amihez egy távolság-transzformációt (distance transformation) használtunk. Ez a transzformáció az objektum kerületi pontjait minimum értékre módosítja, és az objektum belseje felé haladva rétegenként egyre nagyobb pixelértékeket rendel a szintekhez.

Az így kapott eredményképen attól függően, hogy milyen az alakzat formája egy vagy több lokális maximum alakul ki az objektumon belül (11. kép).

11. kép: Borgefors távolság-transzformáció (súlypontok meghatározása)

A transzformációt többféleképpen is elő lehet állítani. Irodalomkutatásunk alapján a leggyorsabb eljárásnak a Borgefors algoritmus bizonyult, ezért ezt az eljárást építettük bele programunkba.

A Borgefors algoritmus lényege, hogy egy bináris képen egy távolságtérképet kapjunk az egyszerűbb modellezés kedvéért. Esetünkben nem ezt a tulajdonságát használjuk ki, hanem a lokális maximum helyek gyors meghatározását. Lokális maximum helynek azokat a pontokat nevezzük, melyek közvetlen környezetében kisebb értékű pontok helyezkednek el (8-as szomszédság) mint az adott pont.

Az algoritmus három lépésből áll. Az első egy inicializálás, melyben az objektum pontjait nem 1-esek jelzik, hanem végtelen nagy érték. Második lépésben a kép bal felső sarkából indítunk egy 3x3-as maszkot, melynek értékei a következők:

Ezeket az értékeket hozzáadva az inicializálás után kapott értékekkel, kapunk egy 9 elemű tömböt. Ebből a tömbből kell kiválasztani a legkisebb értékű elemet, és ezt kell visszaírni a középső helyre. Miután végigvittük ezt a maszkot a képen, harmadik lépésként egy hasonló maszkot indítunk, de most a kép jobb alsó sarkából. Ennek a maszknak az értékei a következők:

          Ezután meghatároztuk a lokális maximumo(ka)t és egy feltételvizsgálattal csoportosítottuk az egyes alakzatokat a talált maximumok számától függően. A további feldolgozásból kihagytuk azokat az objektumokat, amelyek 3 vagy annál több lokális maximmal rendelkeznek, mert nem tudtunk gyors eljárást írni a feladatra. Az egy súlypontú objektumokat alaksajátossági szűrésnek vetettük alá (biztonsági okból), mivel elképzelhető, hogy még ezek között is található megfelelő sejtmag. A két lokális maximummal rendelkező alakzatokat, az alábbi eljárással választottuk szét. A két súlypont által meghatározott egyenesnek vettük a szakaszfelező merőlegesét (m). A két súlypont között felvettük az összes m-mel párhuzamos egyenest, majd eltároltuk az egyenesek által lefedett objektumpixelek számát. Ott vágtuk el az egyenessel az objektumot, ahol ez az érték minimális volt (12. kép).

12. kép: Összeragadt objektumok szétvágása

A szétvágást követően a darabokat már külön kezeltük, és mindkettőt alaksajátosság szempontjából szűrtük.

6.3. Denzitás szűrés

          Végül a második szűrőn átment objektumokat denzitás alapján is szűrtük. Erre azért volt szükség, mert nem kizárt hogy olyan kerek objektumok is maradtak, amelyek az eddigi szűrések ellenére sem sejtmagok. Viszont a sejtmagok illetve az egyes szennyeződések denzitása élesen eltér egymástól. Az egyes objektumok denzitását úgy számoltuk ki, hogy pixelértékeit (RGB) összeadtuk és normalizáltuk. Az átlagtól való eltérés alapján történik a szűrés, amit százalékosan megadhat a felhasználó, alapértelmezésként 10 %.

            Az objektumokon elvégzett szűrési folyamatok elvi megvalósítását az alábbi folyamatábra szemlélteti:



7. Adatok kigyűjtése, eredménykép

          A szűrést követően a sejtmagok adatait egy a beállított paramétereket tartalmazó (köralak mértéke, denzitás) fájlba mentjük, melyben az összesített adatok is szerepelnek (a képen található sejtmagok száma, sejtmagok kerületének, területének és átmérőjének átlaga és szórása). Ezen kívül a felhasználót egy előugró ablak tájékoztatja az összesített adatokról, és előáll egy eredménykép, melyen ellenőrizni lehet a detektálás helyességét, a detektált sejtmagok zöld befoglaló kerettel jelennek meg.

13. kép: Eredménykép

Az egyes detektált sejtmagokra kattintva a felhasználó az adott sejtmagra vonatkozó információkat is le tudja kérdezni.

8. Statisztikai kiértékelés

A statisztikai elemzés tulajdonképpen a normál és a kezelt állatokból vett szövetminták közötti különbséget vizsgálja. Vagyis, hogy a kezelés hatására a sejtmagok tulajdonságai szignifikánsan változtak e vagy sem. Az elemzéshez, a felhasználó által bekért (csoportok szerint) a szövetminták alapján készült adatfájlokat használjuk, melyek minden egyes sejtmagra vonatkozó adatot tartalmaznak. A kiértékelést t-próbával végezzük p=0,05 szignifikancia szinten.

Összegzés

            A program gyorsan és hatékonya képes detektálni a sejtmagokat (egy kép elemzése átlagosan 0,5s), ez rengeteg időt és energiát spórol meg a szövettan elváltozásokat vizsgáló patológusoknak, illetve toxikopatológusoknak. A statisztikai elemzés pedig fényt derít arra, hogy történtek-e szignifikáns változások a sejtmagok méretében illetve formájában. Ezáltal a program teljesítette az élőkövetelményekben leírtakat.

            Fontosnak tartjuk viszont a program továbbfejlesztését, illetve kibővítését. Amint azt a 7.2 fejezetben leírtuk, azokat a sejtösszeragadásokat, ahol kettőnél több sejtmag vagy objektum volt összeragadva, kizártuk a további elemzésből, mert nem tudtunk rá megfelelően hatékony eljárást írni. Irodalomkutatásunk során viszont találtunk megfelelő algoritmust (Watershead) a probléma megoldására, szeretnénk ezt a későbbiekben beépíteni a programba. [9]

A statisztikai kiértékelésre használt t-próba nem veszi figyelembe azt, hogy az adott sejtmag melyik állat szövetmintájából lett véve (a csoporton belül), ezáltal összemosódnak az egyedre vonatkozó – egyes esetekben – jellegzetes tulajdonságok. További fejlesztésként olyan lineáris modell integrálását tervezzük, amiben a fix faktorok (pl. kezelés, stádium) mellett random faktorokat is kezelni tudunk (pl. egyed, metszet), erre lineáris kevert modellek (Generalized Linear Models) alkalmazása tűnik kézenfekvőnek [10]

A sejtmagok morfometriai vizsgálata mellett egy másik megközelítésnek is jelentősége lehet a szövettani metszetek kvantitatív feldolgozása során. Lehetséges, ugyanis, hogy a kezelést követően a sejtmagok morfometriája nem változik meg nagymértékben, viszont a vegyszerek hatására az aktív sejtmagok térbeli struktúrája nagymértékben átalakul. Ez a megközelítés nem az egyes sejtmagokat jellemző paramétereken alapszik, hanem a sejtek, szöveti elemek térbeli (spatial) mintázatának összehasonlítható számszerűsítésével írja le a vizsgálat tárgyát. A szöveti elemek
(pl. sejtmagok) térbeli elhelyezkedése mutathat szabályos, véletlenszerű vagy aggregált mintázatot, ezek kvantifikálására a térbeli epidemiológiában is használatos módszereket ajánlják egyes szerzők.
[11],[12]


Irodalomjegyzék

[1] - Sejt, Wikipédia, szabadlexikon

URL: http://hu.wikipedia.org/wiki/Sejt

[2] - Eötvös Loránd Tudományegyetem (ELTE) Természettudományi Kar (TTK) Biológiai Intézet - mikrotechnikai alapismeretek: a biológiai anyag előkészítése fény –és elektronmikroszkópos morfológiai vizsgálatokhoz.

URL: http://cerberus.elte.hu/Modszerek/Modszerek_jegyzet.rtf

[3] - OTSU, N. 1979: A thresholding selection method for grey-level 

histograms. IEEE Trans Systems, Man and Cybernetics SMC-9(1): 62-66.

[4] - Ball, G. and D. Hall, 1965, “ISODATA: a novel method of data analysis and classification”, Technical Report AD-699616, SRI, Stanford, CA.

[5] - Varriancia differencia between classes

URL:   http://www.stat.psu.edu/~jiali/pub/it00.pdf

http://esds.mcc.ac.uk/VisualInterface/CommonGIS/doc/english/Maps.htm

[6] - Niblack, Wayne, 1986. "An Introduction to Digital Image Processing", Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ.

[7] - Gonzales, Woods: "Digital Image Processing", Prentice  Hall, 2002

[8] - G. Borgefors, "An improved version of the chamfer matching algorithm," in7th Int. Conf. Pattern Recognition, Montreal, P.Q., Canada, 1984, pp. 1175-1177.

[9] – Watershead Transform

URL: fcl.uncc.edu/mcshin/dip/lecture/13.watershed-transform.ppt

[10] - Modern Applied Statistics with S. Fourth Edition. by W. N. Venables and B. D. Ripley. Springer. ISBN 0-387-95457-0, 2002. (272–279, 292)

[11] - Mattfeldt, T., Clarke, A. & Archenhold, G. (1994) Estimation of the directional

distribution of spatial fibre processes using stereology and confocal

scanning laser microscopy. J. Microsc. 173, 87–101.

[12] - Rudolf Karch, Friederike Neumann, Robert Ullrich etc. (2005 March) The spatial pattern of coronary capillaries in patients with dilated, ischemic, or inf lammatory cardiomyopathy

Találat: 1311